Этапы пцр анализа

Проведение ПЦР-анализа (PCR diagnostics) начинается с забора материала для исследования врачом-гинекологом, урологом или дерматовенерологом. Качество, достоверность полученных впоследствии результатов обеспечивается высочайшей квалификацией и огромным опытом работы врачей медицинского центра «Евромедпрестиж» , соблюдающих все необходимые правила проведения ПЦР-анализа: полная стерильность, использование исключительно одноразовых материалов.

Забранный материал со щеточки помещают в контейнер с физраствором. После забора пробы как можно скорее должны быть доставлены в ПЦР — лабораторию.

Проведение в лаборатории ПЦР-анализа происходит в три этапа:

  1. Выделение ДНК
  2. Амплификация ДНК-фрагментов
  3. Детекция ДНК-продуктов амплификации

Выделение ДНК — это первоначальный этап проведения ПЦР-диагностики, суть которого заключается в следующем: врач забирает у пациента материал для исследования и подвергает его специальной обработке. В процессе обработки происходит расщепление двойной спирали ДНК на отдельные нити. В материал пациента добавляется специальная жидкость, растворяющая органические вещества, мешающие «чистоте» проведения реакции. Таким образом удаляются липиды, аминокислоты, пептиды, углеводы, белки и полисахариды. В результате образуется ДНК или РНК.

Принцип метода ПЦР заключается в «строительстве» новых ДНК или РНК инфекций. Без удаления клеточного материала осуществить это невозможно.

Количество времени, затраченного на выделение ДНК, зависит от возбудителя инфекции и от вида используемого для исследования методом ПЦР материала. Например, для подготовки крови к следующему этапу требуется 1,5–2 часа.

Наименование услуги Стоимость
Жидкостная цитология 2 200 руб.
Соскоб на грибы (демодекс) 650 руб.
Анализ мочи общий 350 руб.
Анализ мочи (2-х стаканная проба) 630 руб.
Анализ кала общий (копрограмма) 430 руб.
Смотреть весь прайс-лист

Амплификация ДНК

Для осуществления следующего этапа ДНК-диагностики — амплификации ДНК — врачи используют так называемые ДНК-матрицы — молекулы ДНК инфекций, на которые впоследствии будет происходить «клонирование» ДНК. Уже упоминалось, что наличие полной ДНК инфекции необязательно, для проведения этого этапа достаточно небольшого кусочка молекулы ДНК, который присущ только данному микробу (инфекции).

В основе амплификации ДНК и соответственно в основе всего принципа ПЦР-реакции лежит естественный для всего живого процесс достраивания ДНК — репликации ДНК, который осуществляется путем удвоения единичной цепочки ДНК.

Начав с одного-единственного фрагмента ДНК, врач-лаборант копирует его и увеличивает количество копий в режиме цепной реакции: после первого цикла у вас уже есть 2 фрагмента, после второго цикла — 4, после третьего — 8, после четвертого — 16, затем 32, 64, 128, 256. С каждым циклом происходит удвоение числа копий, и после двадцати циклов счет уже идет на миллионы, а после тридцати — на миллиарды. Цикл длится считанные минуты и сводится к определенному изменению температурного режима в очень небольшом химическом реакторе. Здесь в растворе в достаточном количестве находятся все нужные компоненты синтеза, прежде всего, нуклеотиды А, Г, Т и Ц, а также проведены тонкие подготовительные химические операции для того, чтобы с каждого готового отрезка ДНК тут же снималась точная копия, затем с этой копии — снова копия, в этом и состоит разветвленная цепная реакция.

Путем присоединения к цепи ДНК праймеров — искусственно синтезированных «кусочков» ДНК (нуклеотидных пар), аналогичных ДНК микробов (инфекции) — образуются две короткие, состоящие из двух цепей участков ДНК, спирали, необходимые для синтеза будущей ДНК.

Синтез новой цепи происходит путем достраивания каждой из двух нитей ДНК. Процесс амплификации происходит с помощью специфического участка — ДНК-полимеразы, давшему название лабораторному методу. Полимераза выступает в роли катализатора реакции и следит за последовательным прикреплением нуклеотидных оснований к растущей новой цепи ДНК.

Таким образом, амплификация ДНК представляет собой многократное увеличение числа копий ДНК, которые специфичны, т. е. присущи только определенному организму. Нет необходимости достраивать всю цепь ДНК, чтобы увидеть возбудителя инфекции. Нужен только тот участок, который характерен для данной бактерии как для индивидуальности.

О методе ПЦР-диагностики

Читайте также:  Как узнать когда были последние месячные

Основы метода

Основные этапы ПЦР

подготовки исследуемой пробы материала, которая в большинстве случаев сводится к выделению ДНК или РНК;

собственно полимеразной цепной реакции;

детекции продукта ПЦР (амплифицированной нуклеиновой кислоты).

Выделение ДНК/РНК

Проведению ПЦР предшествует стадия выделения и преципитации ДНК из исследуемого материала. Это обеспечивает концентрирование обнаруживаемой ДНК инфекционного агента в минимальном объеме жидкости, используемой в ПЦР. В случаях, когда не требуется достижения высокой чувствительности анализа, например, при идентификации МБТ после первичного культивирования, достаточна их обработка, позволяющая лишь разрушить микробную стенку: нагревание в лизирующем буфере, ультразвуковая обработка или использование ферментов (лизоцим) без последующего выделения ДНК.

При отсутствии в пробе ингибиторов Taq-полимеразы (гемоглобина или других) и наличия десятка копий ДНК-матрицы в объеме, вносимом в пробирку со смесью всех реагентов ПЦР, подготовка пробы может быть полностью исключена. Например, вирус гепатита В в сыворотке крови и многие возбудители инфекционных менингитов в спинномозговой жидкости можно детектировать методом ПЦР без всякой подготовки, без предварительного выделения из них ДНК. В большинстве случаев из исследуемой пробы крови, сыворотки, лейкоцитов, биоптатов, мочи, мокроты для исключения ложноотрицательного результата следует выделить ДНК тем или иным способом. Благодаря этому происходит концентрирование исследуемой ДНК-матрицы в малом объеме и удаление ингибиторов Taq-полимеразы.

В настоящее время используется несколько способов подготовки образца для проведения ПЦР. Процедура подготовки пробы включает лизис микроорганизма и экстракцию нуклеиновой кислоты. С целью разрушения клетки используют простое кипячение, замораживание-оттаивание в присутствии лизоцима, а также специальные лизирующие буферы, содержащие детергенты и протеиназу. Выбор метода диктуется природой микроорганизма, а точнее – природой его клеточной стенки.

Для экстракции ДНК используют два основных метода. Во-первых, применяют классическую процедуру фенольно-хлороформной экстракции. При этом достигается хорошая очистка ДНК и, в первую очередь, от ингибиторов Taq-полимеразы, но неизбежны большие потери нуклеиновой кислоты, особенно заметные при работе с образцами небольшого объема с низкой концентрацией инфекционного агента. Другой способ, применяемый для очистки нуклеиновой кислоты, основан на использовании сорбентов. Подготовка материала с его использованием занимает меньше времени и более проста в исполнении, хотя не всегда может быть применена, так как не гарантирует удаление возможных ингибиторов.

Постановка ПЦР

Для проведения ПЦР в реакционный буфер вводят определенное количество коротких (15-30 пар оснований) олигонуклеотидов (праймеров), комплементарных последовательностям, фланкирующим участок ДНК, копию которого хотят получить. Праймеры подбирают таким образом, чтобы их 3′ -концы были ориентированы навстречу друг другу, т.е. синтезировался фрагмент ДНК, заключенный между праймерами. ПЦР проводят следующим образом: сначала реакционную смесь нагревают до температуры 90-94° С, вызывая этим денатурацию ДНК, затем температуру снижают до 50-65° С в зависимости от нуклеотидной последовательности праймеров, чтобы отжиг происходил в строго комплементарных участках, и, наконец, в смеси устанавливают температуру, оптимальную для работы ДНК-полимеразы. При воспроизведении этого цикла количество копий участка ДНК, находящегося между местами отжига праймеров, возрастает в логарифмической зависимости, т.е. от одной двухцепочечной молекулы можно получить 2 n одноцепочечных копий, где "n" равно количеству циклов.

Применение термостабильных полимераз требовало выяснения зависимости их синтетической активности от условий реакции. Исследование связи активности фермента с температурой показало, что некоторую активность (несколько десятков пар оснований, включенных в синтезируемую цепь в течение одной минуты) можно наблюдать при комнатной температуре. Заметное увеличение активности наблюдалось при температурах 50-65° С, а от 65° до 75-79° С была установлена логарифмическая зависимость синтетической активности от температуры. Надо отметить, что на активность фермента оказывают влияние большое число факторов, и поэтому приведение точных данных о максимальной активности Taq-полимеразы затруднено.

Специфичность ПЦР и количество амплифицируемой ДНК, которое определяет чувствительность, могут значительно варьировать в зависимости от концентрации и качества 5 основных компонентов реакционной смеси (ДНК-матрицы, Taq-полимеразы, праймеров, dNTP и ионов Mg) и температурного режима ПЦР.

Даже при оптимальных концентрациях фермента, ионов Mg, праймеров и dNTP специфичность и чувствительность ПЦР очень сильно зависит от температуры отжига праймеров (2-я стадия цикла ПЦР): неспецифичность ПЦР-амплификации повышается при снижении температуры отжига ниже оптимальной и при повышении концентраций праймеров и dNTP выше оптимальных, а при повышении температуры отжига выше оптимальной снижается выход специфической амплифицируемой ДНК вплоть до ее полного исчезновения .

Читайте также:  Икота как от нее избавиться

Детекция продукта ПЦР

Присутствие специфического ПЦР-продукта (ампликона) детектируют электрофоретическим разделением ПЦР-амплификационной смеси на окрашенном бромистым этидием агарозном или полиакриламидном гелях или альтернативными технологиями. Бромистый этидий образует с фрагментами ДНК устойчивое соединение, проявляющееся в виде светящихся полос при облучении геля УФ-излучением с длиной волны 290-330 нм. Полосы визуализируют с помощью ультрафиолетового подсвечивания в трансиллюминаторе и последующим фотографированием. Специфичность полосы амплифицированной ДНК подтверждается ее положением (размерами) по отношению к маркерным фрагментам и ДНК-стандарту. Положительный результат оценивают по расстоянию пробега визуализированной полосы, соответствующему полосе положительного контроля, что свидетельствует о синтезе фрагмента ДНК, равного по размерам положительному контролю. Для такого выявления необходимо не менее 20 нг ДНК.

Дополнительные доказательства специфичности ампликона можно получить путем расщепления специфическими рестриктазными ферментами или путем гибридизации со специфическим радиоактивным или флуоресцентным олигонуклеотидным зондом. При жидкостно-фазной гибридизации зонд добавляется к амплификату, а затем производится электрофорез в геле. При твердофазной гибридизации амплификат фиксируется на мембране, а затем гибридизируется с зондом. Такое подтверждение специфичности в практической диагностике производится редко, по необходимости.

При определении амплифицированной ДНК методом Саузерн-блота и дот-гибридизации отмечено повышение чувствительности анализа, но для получения ответа требуется дополнительно 1-2 дня.

Прямое секвенирование амплифицированной ДНК является также высоконадежным методом доказательства специфичности, но применяется в основном для идентификации точечных мутаций генов.

Требования к помещениям ПЦР-лабораторий

ПЦР-лаборатория должна быть разделена на зоны (комнаты). Следует иметь не менее двух комнат:

пре-ПЦР-помещение, где проводится обработка клинических образцов, выделение ДНК, приготовление реакционной смеси для ПЦР и постановка ПЦР (при наличии условий два последних этапа – приготовление реакционной смеси и постановка ПЦР рекомендуется также проводить в дополнительном отдельном помещении); в этих помещениях запрещается проводить все другие виды работ с инфекционными агентами (микробиологический анализ, ИФА, другие диагностические тесты);

пост-ПЦР-помещение, где проводится детекция продуктов амплификации. В пост-ПЦР-помещении допускается использовать другие методы детекции инфекционных возбудителей, диагностика которых проводится в данной лаборатории. Комнату детекции продуктов амплификации (пост-ПЦР-помещение) следует располагать как можно дальше от пре-ПЦР-помещения. Следует исключить движение воздушного потока из пост-ПЦР-помещения в пре-ПЦР-помещение.

Важным моментом организации работы является использование для каждой стадии процесса отдельного оборудования, реагентов, соблюдение чистоты на рабочем месте, обработка поверхностей 0,5% раствором гипохлорита натрия и ультрафиолетовое облучение.

ПЦР это аббревиатура для обозначения полимеразной цепной реакции, которая является основным методом молекулярной биологии.

По существу, основной целью полимеразной цепной реакции является быстрое увеличение количества копий определенных участков ДНК.

Продукт ПЦР выступает в качестве средства для дальнейшего анализа. Например, амплификат используется в гель-электрофорезе для обнаружения различных последовательностей ДНК.

Сегодня различные виды ПЦР, в сочетании с другими технологиями, находят многочисленные приложения в таких областях, как судебная медицина, сельскохозяйственные науки, медицина и т. д. Метод полимеразной цепной реакции используется для диагностики заболеваний, клонирования и секвенирования генов.

ПЦР-амплификацию можно проводить с использованием ДНК из различных источников. Это очень чувствительный метод и для получения количества копий достаточного для обычного лабораторного анализа требует только следовых количеств ДНК.

ПЦР повышает количество фрагментов матричной ДНК

3 основные стадии ПЦР амплификации ДНК

Полимеразная цепная реакция представляет собой трехстадийный циклический процесс, состоящий из определенных этапов, различающихся между собой по времени проведения и температуре.

3 основных этапа ПЦР включают:

  1. шаг денатурации (denaturation);
  2. этап отжига (annealing);
  3. шаг элонгации (удлинения или синтеза, elongation).

Каждый из этих шагов повторяется 30-40 раз (циклов).

В течение каждого цикла реакционная смесь подвергается воздействию трех разных температур.

Температурный профиль 3 основных стадий ПЦР

Во время последовательных циклов основных этапов ПЦР (денатурация, отжиг и элонгация) все новосинтезированные нити ДНК будут действовать как шаблоны, вызывая экспоненциальное увеличение количества производимой ДНК.

Каждый цикл удваивает количество молекул ДНК (ампликонов), синтезируемых из ДНК шаблона.

Этап ПЦР денатурации

Первым из трех стадий ПЦР является этап денатурации.

Читайте также:  Белые полосы на ногтевой пластине

Во время стадии денатурации водородные связи, которые удерживают вместе две нити двухцепочечной ДНК, разрушаются, и эти нити расходятся друг от друга.

Этот процесс высвобождает одноцепочечную ДНК, которая выступает в качестве ДНК матрицы на этапе элонгации.

Температура денатурации устанавливается выше 90°C (обычно 94°C). Продолжительность этой стадии может доходить до одной минуты (обычно 30 секунд).

Этап ПЦР отжига

На стадии отжига праймеры выстраиваются на одноцепочечных нуклеотидных последовательностях ДНК-мишени в соответствии с правилами спаривания оснований.

Это обыкновенная зависящая от температуры реакция ДНК : ДНК гибридизации которая нуждается в оптимизации.

Это единственная стадия ПЦР амплификации ДНК температура которой может варьировать в широких пределах.

Температура этой стадии зависит от точной последовательности и длины праймеров.

Обычно реакционную ПЦР смесь охлаждают до 40-60°С.

Тем не менее, температуры отжига для ДНК-шаблонов с высоким содержанием GC пар могут достигать 72°C (нормальная температура этапа элонгации).

Температура для этой стадии ПЦР выбирается для оптимального связывания праймеров с подходящим шаблоном ДНК и зависит от температуры плавления праймеров.

Неудачно подобранная температура отжига может приводить к появлению ложных продуктов реакции или вообще не давать результатов.

Так как праймеры относительно короткие и находятся при высоких молярных концентрациях продолжительность стадии отжига составляет около 30 секунд.

На этой стадии отожженные олигонуклеотиды обеспечивают свободную 3′-гидроксильную группу для Taq ДНК-полимеразы и действуют как праймеры для синтеза ДНК.

Этап ПЦР элонгации (синтеза).

Последний из 3 основных этапов ПЦР является шагом элонгации или синтеза.

Это стадия ДНК проводится термостабильной ДНК-полимеразой.

Температуру стадии элонгации обычно устанавливают на 72°C. Она немного ниже оптимальной для Taq ДНК-полимеразы.

Taq-полимераза синтезирует комплементарные нити ДНК, начиная с праймеров.

Скорость синтеза составляет примерно 1000 пар оснований в минуту.

Поэтому для амплификации ДНК-шаблона, который имеет длину 500 оснований, при нормальных условиях время этапа ПЦР элонгации должно составлять не менее 30 секунд.

Обычно для синтеза каждых 500 пар оснований ДНК матрицы требуется 30 секунд.

Циклы ПЦР амплификации

В течение самого первого цикла полимеразной цепной реакции единственными шаблонами, доступными для отжига праймеров, являются участки исходной ДНК, полученной из соответствующего источника.

Поскольку исходный ДНК шаблон во много раз превышает длину требуемого ампликона, полимеризация первого цикла будет продолжаться до тех пор, пока она не будет прервана на стадии денатурации второго цикла ПЦР.

В конце первого цикла полимеразной цепной реакции на каждую двухцепочечную ДНК, с которой началась реакция, приходится две новых молекулы двухцепочечной ДНК.

Каждая из них содержит одну нить исходного шаблона и одну новую нить, которая ограничена на одном конце олигонуклеотидным праймером, а с другой стороны – тем, насколько полимеризация (синтез ДНК) могла протекать во время этапа элонгации.

Эти продукты полимеразной цепной реакции образуют ДНК-шаблоны, которые ограничены только на одном конце (semi-bounded DNAs).

Во втором цикле как исходные мишени ДНК, так и ограниченные на одном конце ДНК будут служить в качестве шаблонов.

Исходные ДНК-шаблоны будут продолжать производить ограниченные на одном конце ДНК в каждом цикле ПЦР реакции.

Начиная со второго цикла ПЦР ДНК амплификации, ограниченные на одном конце ДНК будут образовывать продукты ПЦР – ампликоны.

В каждом последующем цикле исходные шаблоны ДНК, ограниченные на одном конце ДНК и ампликоны будут служить в качестве шаблонов для праймеров ПЦР.

В реакционной смеси ПЦР:

  1. количество матричной ДНК не изменяется;
  2. количество ограниченные на одном конце шаблонов ДНК увеличивается арифметически каждый цикл;
  3. число ампликонов увеличивается геометрически каждый цикл, начинающийся с цикла 2.

В конце 35 циклов ПЦР на каждую исходную последовательность ДНК-шаблона приходиться более 34 миллиардов копий ДНК-ампликонов.

Разработка программируемого термоциклера помогла расапространению ПЦР технологии.

Программируемый термоциклер основан на металлических нагревательных блоках с отверстиями для пробирок и предназначен для переключения между запрограммированной последовательностью температур ПЦР шагов.

Якутина Светлана
Якутина Светлана
Эксперт проекта ProSosudi.ru
Статья помогла вам?
Дайте нам об этом знать - поставьте оценку
1 Star2 Stars3 Stars4 Stars5 Stars (No Ratings Yet)
Загрузка...

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *